La Galerie nationale a été créée grâce à une donation du juriste Alexandros Soutzos qui légua sa fortune à l’État grec en 1896 pour la création d’un musée des beaux-arts. La Galerie fut inaugurée quatre ans plus tard, le 28 juillet 1900. 

À l’origine, 258 œuvres provenant des collections de l’École polytechnique (qui avait créé quelques années auparavant une petite galerie) et de l’Université y furent exposées. S’y ajoutèrent, l’année suivante, 107 œuvres de la collection d’Alexandros Soutzos, dont l’État avait également hérité.

Les collections permanentes comptent notamment des peintures grecques modernes (à partir du XIXe siècle), des peintures occidentales, des gravures grecques et européennes, des œuvres d’arts décoratifs et appliqués, ainsi que des sculptures grecques modernes et européennes.