Die Gründung der Nationalgalerie erfolgte nach einer Schenkung des Juristen Alexandros Soutsou, welcher 1896 sein Vermögen dem Staat vermachte, damit dieser ein Kunstmuseum einrichten konnte. Vier Jahre später, am 28. Juli 1900, konnte die Nationalgalerie ihren Betrieb aufnehmen. 

Anfänglich umfasste die Ausstellung 258 Werke aus den Sammlungen der Technischen Hochschule (wo einige Jahre zuvor ein kleiner Galeriebetrieb aufgenommen worden war) sowie der Universität. Im darauffolgenden Jahr kamen weitere 107 Werke aus der Sammlung des A. Soutsou hinzu, welche er ebenso dem griechischen Staat vermacht hatte.

Unter den Kunstwerken der ständigen Ausstellungen befinden sich Werke neugriechischer Malerei (aus dem 19. Jh.), Werke westeuropäischer Maler, moderne griechische und europäische Radierungen und Kunsthandwerk sowie neugriechische und europäische Skulpturen.